Allestimento di preparati biologici in microscopia ottica ed elettronica, Gaetano Odierna « Citologia ed Istologia « Scienze Matematiche Fisiche e Naturali « Federica e-Learning vendita del campione di cristiana di louboutin

Gaetano Odierna » 3.Allestimento di preparati biologici in microscopia ottica ed elettronica


Problematica per l’osservazione dei preparati biolgici

L’osservazione al microscopio ottico o elettronico dei campioni biologici richiede che i preparati siano sufficientemente sottili da risultare trasparenti al fascio di luce o di elettroni e che sia preservata la morfologia delle cellule e degli organelli in esse contenuti.

Tecnica delle fette

In microscopia ottica il procedimento comunemente in uso per l’allestimento dei preparati è la “tecnica delle fette” di campioni inclusi in paraffina. La tecnica prevede i seguenti passaggi:

  1. prelievo organo;
  2. fissazione;
  3. lavaggio;
  4. disidratazione (tramite serie ascendente degli alcol);
  5. chiarificazione in solventi organici (xilene – Histolemon);
  6. inclusione in paraffina;
  7. sezioni al microtomo;
  8. distensione delle fette su vetrini;
  9. sparaffinatura in sol IWC-Saint-Exupery/kauokagy. louboutin bryllup skoventi organici;
  10. idratazione delle fette tramite la serie discendente degli alcool;
  11. colorazione;
  12. disidratazione tramite serie ascendente degli alcool;
  13. chiarificazione;
  14. montaggio in balsamo (resine sintetiche).

Tecnica delle fette: prelievo e fissazione

1 – Prelievo: il prelievo dell’organo, solitamente di dimensioni al di sotto del cm3, va eseguito rapidamente, e se necessario, iniettando il fissativo via perfusione.

2 – Fissazione: ha lo scopo di bloccare la lisi delle cellule e dei tessuti e di preservarne il più possibile la struttura.


Tecnica delle fette: fissazione e disidratazione


Tecnica delle fette: inclusione in paraffina

6 – Inclusione in paraffina: viene effettuata in paraffina liquida, mantenuta a 60° in apposite stufe dove, preferibilmente, è possibile effettuare il vuoto.

Preparazione blocchetti: il campione è contenuto in paraffina liquida, contenuta in contenitori prestampati o in lamelle di rame. La paraffina è poi lasciata solidificare a temperatura ambiente per 24 ore.

Lamelle di rame
Blocchetti pronti per il taglio al microtomo

Tecnica delle fette: sezioni al microtomo

7 – Sezioni al microtomo Il Microtomo: è uno strumento che permette di ottenere fette del campione incluso in paraffina dello spessore di 3-10 μm.

8 – Distensione delle fette su vetrini: si ottiene mettendo le fette sulla superficie dell’acqua portata ad una temperatura tra i 40-50 °C.

Affettatura

Affettatura


Tecnica delle fette: colorazione e montaggio in balsamo

9 – Sparaffinatura in solventi organici: elimina la paraffina dalle fette.

10 – Serie discendente degli alcool e idratazione: viene effettuata gradualmente tramite passaggi in alcol a gradazione decrescente.

11 – Colorazione: può essere dicromica (emallume -eosina; prima immagine) o tricromica (ad esempio tricromica di Mallory; seconda immagine).

12 – Disidratazione: si effettuta tramite il passaggio dei vetrini nella serie ascendente degli alcool.

13 – Chiarificazione: si effettuata tramite il passaggio in solventi organici.

14 – Montaggio in balsamo: consiste nell’interporre uno strato di resina sintetica tra vetrino porta- e coprioggetti.

Colorazione dicromica (Emallume eosina)
Colorazione tricromica di Mallory
Colorazione

Tecnica delle fette in Microscopia elettronica

In linea di principio l’allestimento dei preparati biologici in microscopia elettronica segue gli stessi criteri della microscopia ottica. Tuttavia sono previsti importanti modifiche:

  • Prelievo: le dimensioni del campione sono di solito dell’ordine di 1-2 mm3. Il prelievo va effettuato a freddo in specifici tamponi.
  • Fissazione: è eseguita a freddo con fissativi chimici non coagulanti (es. paraformaldeide, gluteraldeide) a cui segue in genere la post-fissazione in tetrossido di osmio.
  • Inclusione: il campione viene incluso in plastica (resine epossidiche).
  • Sezioni: si usa l’ultramicrotomo con cui si possono ottenere sezioni ultrafini (80-100 nm). Si usano lame di vetro o di diamante montate su una bacinella con acqua. Le fette ottenute sono raccolte con un retino di rame.
  • Colorazione: si usano sali di metalli pesanti (opachi agli elettroni) ad esempio Sali di piombo, di platino, di oro, d’argento, etc.
Sezioni con l’ultra-microtomo e raccolta delle fette con il retino di rame

Sezioni con l'ultra-microtomo e raccolta delle fette con il retino di rame


Schema della Tecnica delle fette in Microscopia elettronica

Preparazione dei campioni per l’osservazione in microscopia elettronica. Fonte: G. Karp, Biologia Cellulare e Molecolare, Edises, II Ed. 2004

Preparazione dei campioni per l'osservazione in microscopia elettronica. Fonte: G. Karp, Biologia Cellulare e Molecolare, Edises, II Ed. 2004


Confronto tecniche delle fette in Microscopia ottica ed elettronica


Particolari tecniche in uso in microscopia elettronica

Colorazione negativa – viene applicata soprattutto per lo studio dei virus e delle macromolecole*.

Il campione, sospeso in un colorante elettrondenso, è applicato su un retino ricoperto da un sottile film di plastica. Si asciuga all’aria e si osserva al TEM. Il colorante riempie gli spazi vuoti, che appariranno scuri, mentre i virus o le macromoleche risultano chiari.

* le tecniche di isolamento e purificazione delle macromolecole (glucidi, lipidi, proteine e acidi nucleici) saranno discusse in specifici corsi, quali ad esempio Biochimica. Consultare anche i capitoli delle tecniche nei libri di testo consigliati dal docente del corso.

Batteriofago evidenziato tramite colorazione negativa

Batteriofago evidenziato tramite colorazione negativa


Particolari tecniche in uso in microscopia elettronica II

Ombreggiatura al platino – è usato per lo studio delle macromolecole.

1) Il campione è adsorbito su un supporto liscio (lastra di mica). 2) Sotto vuoto spinto e sotto rotazione, sul campione viene proiettato, sotto un angolo di 5°-15°, un sottile strato di platino (elettron-denso) che evapora da un elettrodo al Platino reso incandescente. 3) Lo strato di platino, che rappresenta la replica della superficie del campione,  è stabilizzato da uno strato di carbone fatto cadere dall’alto da un elettrodo di  carbone (elettron-chiaro).  4) la replica di platino è prima trasferita in un bagno alcalino che degrada il campione e, quindi, dopo lavaggio, (5) è trasferita su un retino per l’osservazione al TEM (6).

Molecole di miosina ombreggiate al platino

Molecole di miosina ombreggiate al platino


Particolari tecniche in uso in microscopia elettronica III

Il freeze etching è una tecnica particolarmente usata per lo studio della struttura interna delle membrane cellulari e delle strutture cellulari interne. Il campione, opportunamente crioprotetto (1), è immerso in azoto liquido (2);  in tal modo l’acqua vetrifica. Il campione è immesso sotto vuoto e quindi è inciso da una lama (3). Il piano di frattura prezerenzialmente avviene lungo il doppio strato delle mambrane biologiche (4). La superficie esposta dalla frattura è poi ombreggiata al platino (5) e rinforzata da una strato di carbone. La sostanza organica del campione viene rimossa mediante digestione alcalina e la replica metallica dopo lavaggio è osservata al microscopio elettronico (6).


Particolari tecniche – metodo di purificazione degli organelli cellulari


Le lezioni del Corso

1. Livelli di organizzazione in Biologia - Storia della citologia

2. Principi e tecniche in microscopia

3. Allestimento di preparati biologici in microscopia ottica ed elettronica

4. Composizione chimica della cellula

5. Principali metodi istochimicici, immuno-istochimici, colture in vitro, autoradiografia

6. Sguardo d'insieme ai virus, alla cellula procariotica ed eucariotica

7. La membrana plasmatica

8. Fisiologia della membrana plasmatica

9. Citoscheletro: generalità e i microfilamenti

10. Citoscheletro: microtubuli e filamenti intermedi

11. Giunzioni cellulari e adesione cellulare

12. Ribosomi, smistamento proteine, reticolo endoplasmatico

13. Apparato di Golgi, Lisosomi

14. Esocitosi, Endocitosi, transcitosi

15. Perossisomi, Mitocondri

I materiali di supporto della lezione

G. Karp - Biologia Cellulare e Molecolare – Edises – II Edizione 2004

Esercitazioni

  • Contenuti protetti da Creative Commons
  • Feed RSS
  • Condividi su FriendFeed
  • Condividi su Facebook
  • Segnala su Twitter
  • Condividi su LinkedIn
Chi siamo | Friendly | Mobile e-Learning | Policy | Email | Facebook | YouTube | Twitter | Pinterest | Flickr
Progetto "Campus Virtuale" dell'Università degli Studi di Napoli Federico II, realizzato con il cofinanziamento dell'Unione europea. Asse V - Società dell'informazione - Obiettivo Operativo 5.1 e-Government ed e-Inclusion

vendita del campione di cristiana di louboutin

discount christian louboutin
Christian Louboutin Herren Schuhe
decollete cristiano louboutin
christian louboutin joggesko for menn
louboutins en oferta

CAMPIONE D'ITALIA
 

Campione d

Il paradiso della canapa legale: corsa all’erba di Carmagnola

Boom di richieste dopo l’assalto alla marijuana “light” della EasyJoint


Pubblicato il 24/05/2017
carmagnola (to)

La canapa più famosa del mondo nasce a Carmagnola, poco meno di trenta chilometri da Torino: è la «mamma» della stragrande maggioranza delle varietà europee e tra le più ricche di cannabinoidi. Nella cittadina piemontese c’è anche la sede di AssoCanapa, coordinamento nazionale per la canapicoltura nato vent’anni fa grazie alla testardaggine di Felice Giraudo, 83 anni tra qualche giorno, un passato come amministratore della Democrazia Cristiana, pioniere del recupero di una coltivazione dalla tradizione secolare che però ha rischiato di andare perduta per sempre.  

 

Nell’ufficio zeppo di semi e piantine, pannelli isolanti e olio, corde e farine, il telefono non smette di squillare. Da qualche giorno arrivano da tutta Italia e dall’estero decine di richieste: crescono sempre più sia gli ordini di semi e di infiorescenze della varietà Carmagnola e Carmagnola Selezionata, sia le domande di aspiranti agricoltori, desiderosi di cimentarsi nella coltivazione di una delle piante più antiche e bistrattate. A far scoprire agli amanti del genere - e a decretare il boom - dei pacchetti di fiori di canapa made in Carmagnola è stata, suo malgrado, la EasyJoint, neonata società bolognese che ha collezionato in pochi giorni centinaia di ordini pubblicizzando la varietà Eletta Campana come la prima «marijuana legale»: erba, ma con un contenuto di tetraidrocannabinolo al di sotto dei limiti di legge. Tanto è bastato per esaurire le scorte, con le spedizioni online e ai negozi specializzati sospese in attesa dei nuovi rifornimenti. La EasyJoint promette un’erba che rilassa, sballa ma non troppo. Ed è pure legale.  

 

Sorride Margherita Baravalle, 72 anni che paiono venti di meno. La presidente di AssoCanapa liquida i novelli profeti della cannabis con un deciso: «Non sanno quel che dicono». Ha ragione. Per il Thc l’unico limite è quello per le coltivazioni, che si misura su un campione di piante. E non ha niente a che vedere con i limiti di Thc degli alimenti e del fumo. Ma se si parla di stupefacenti, funziona così: la marijuana, cioè quel che si ottiene dalle infiorescenze essiccate della canapa, è considerata una droga e come tale è illegale. Una volta sorpresi con dell’erba, la quantità di Thc conta, ma solo per quantificare la pena. 

 

REPORTERS

Felice Giraudo, 83 anni, in un campo di canapa a Carmagnola: in passato è stato un amministratore locale della Dc e da anni ha recuperato la coltura della canapa 

 

La società bolognese, che ieri ha sospeso di nuovo le consegne per non meglio precisate «questioni burocratiche», un merito indiscusso però ce l’ha: parlare di principio attivo al di sotto dei limiti di legge si è rivelata un’ottima strategia di marketing. I tanti che si sono precipitati nei negozi specializzati a caccia della «nuova erba legale» si sono sentiti rispondere che sì, arriveranno rifornimenti dalla EasyJoint, ma che la società bolognese non ha inventato niente di nuovo, anzi. Se di erba «legale» vogliamo parlare, allora bisogna rivolgersi alle oltre 400 aziende italiane di canapa industriale. Con due vantaggi: costa molto meno della metà ed è di ottima qualità. Anche se come da etichetta non ha effetto psicotropo - cioè «non sballa» - è infatti ricca di cannabinoidi, sostanze psicoattive sempre più usate per le loro qualità terapeutiche.  

 

Una regolamentazione sui prodotti da fumo ancora non c’è: la competenza sta tra ministero della Salute, dell’Agricoltura e degli Interni. «Non solo va normata la produzione, ma anche il commercio: bisogna conciliare le esigenze di chi coltiva con quelle di chi deve garantire i controlli sanitari e fiscali – conclude Baravalle -. Se per esempio nel trattamento o nella coltivazione delle infiorescenze vengono usati dei metalli pesanti, ci possono essere dei rischi per la salute. La soluzione? Sedersi a un tavolo con tutti gli interlocutori. Avrò fumato tre sigarette in tutta la vita, ma coltiviamo canapa da più di vent’anni: siamo a disposizione di chiunque vorrà ascoltarci».  

 

home

home

Il bonus bebè diventa stabile, ma durerà solo un anno e l’assegno verrà dimezzato

Copyright © 2017

Sottomarino scomparso in Argentina, “un’infiltrazione ha causato un corto circuito”

LAPRESSE

Copyright © 2017

Partito il primo treno merci che collega l’Italia con la Cina
10 mila chilometri in 18 giorni

Copyright © 2017

Allarmi ignorati, battute e risate: le intercettazioni nella notte del Rigopiano

ANSA

Copyright © 2017

I più letti del giorno

I più letti del giorno

Donna di 43 anni muore travolta dal treno affittato dal Pd per la campagna elettorale di Renzi

Copyright © 2017

Grande Fratello Vip, top e flop della semifinale: fuori Cristiano Malgiolgio

Copyright © 2017

Meteo: è arrivato l’inverno, temperature sotto zero in Piemonte, venerdì (forse) la neve

Copyright © 2017

Ragazza di 22 anni suicida a Olbia, aveva ricevuto ricatti per un video hard

Copyright © 2017

Mar Nero, collisione sfiorata tra un jet spia degli Stati Uniti e un caccia di Mosca

AP

Copyright © 2017

La Stampa Shop

matita la stampa 150° anni

borsa shopper la stampa 150° anni
distintivo la stampa 150° anni
shop